Рак молочной железы: прогностические маркеры метастазов

   Рак молочной железы считается наиболее распространенным видом злокачественных новообразований и 2-й ведущей причиной смерти от рака у женщин [1]. Поражение лимфатических узлов в области молочной железы и отдаленные метастазы являются наиболее важными прогностическими факторами для пациентов [2]. Из-за сниженной перфузии в солидных опухолях под действием гипкосии (снижение рО2) образуются гетерогенные области. Кроме того, известно, что измененный метаболизм образований также может способствовать гипоксии опухоли [3]. Было обнаружено, что гипоксия является пусковым механизмом появления опухоли, прогрессирования, увеличения числа метастазов и развития резистентности к терапии у многих типов рака, а также является прогностическим маркером низкой выживаемости [4]. Кроме того, оценка гипоксии в разных регионах опухоли может помочь решить, у каких пациентов будет эффективна антигипоксическая терапия, а также насколько она эффективна, особенно при раке молочной железы. Достаточно простой метод обнаружения гипоксии может быть сделан путем оценки экспрессии эндогенных гипоксия-ассоциированных белков в биопсийном материале опухоли с использованием иммуногистохимии, например, гипоксия индуцибельный фактор-1 альфа (HIF-1α  - Hypoxia Inducible Factor-1 Alpha) и карбоангидраза IX (CAIX - Carbonic Anhydrase Isoform 9) [6].

Белок HIF-1α разрушается и удаляется в течение нескольких минут в условиях нормальной концентрации кислорода, тогда как он активируется во время гипоксии. Когда он стабилизируется, он транслоцируется в ядро, активируется и образует активный комплекс транскрипции. После этого он связывается с элементом ответа при гипоксии в промоторах разных генов-мишеней, что может позволить увеличить доступность кислорода и/или увеличить метаболическую адаптацию к гипоксии [7]. CAIX представляет собой гликопротеин, который считается основной мишенью HIF-1α; его экспрессия связана с прогнозом при некоторых видах рака [8]. Таким образом, он считается привлекательным эндогенным маркером наличия гипоксии и оценивается при прогнозе рака [9]. Связь между экспрессией HIF-1α и CAIX в раковых клетках, основной механизм действий обоих маркеров и их роль в индукции гипоксии остается неясной. Хотя в нескольких исследованиях была оценена экспрессия обоих маркеров при многих видах раках, включая рак молочной железы. Однако, до сих пор не было обнаружено достоверной роли в отношении их клинико-патологических и прогностических характеристиках у пациентов с раком молочной железы [4, 5].

Цель работы

Цель работы заключалась в оценке

- экспрессии HIF-1α и CAIX при раке молочной железы,

- корреляции их уровней экспрессии друг с другом,

- корреляции с наличием пораженных лимфатических узлов и отдаленными метастазами

- корреляции уровнями выживаемости у женщин с раком молочной железы.

Пациенты и методы.

Начало проведения исследования было в июле 2014 года, окончание - в июле 2017 года. В исследование вошло 90 женщин с раком молочной железы. Всем пациенткам была выполнена модифицированная радикальная мастэктомия. После чего, образцы тканей были направлены в отделение патологии медицинского факультета Университета Загвзиг. С помощью стандартных патологических и гистопатологических исследований была диагностирована карцинома молочной железы. Для единой классификации опухолей была использована система (8-е издание) Ноттингема (Elston-Ellis) и ее модификации (Scarff. Bloom Richardson) [10,11]. Исследователи определили срок, размер опухоли, гистопатологический подтип, степень, стадию рака, путем анализа данных пациенток и образцов отделения патологии. ER, PR-гормональные рецепторы и экспрессия Her2 neu и индекс маркировки Ki67 были оценены во всех случаях. Специалисты вели наблюдение за пациентами до смерти или до ремиссии заболевания, в среднем период составил от 15 до 36 месяцев.

Техника иммуногистохимического окрашивания

Исследователи использовали общую методику с применением иммунопероксидазы стрептавидин-биотин для окрашивания [ 12]. Образцы тканей были фиксированы формалиновыми блоками, содержащих парафин. Была выполнена блокада активности эндогенной пероксидазы, произведено нагревание в автоклаве, инкубация с моноклональным анти-HIF-1α мыши (Calbiochem, Германия, разведенным 1: 300) и поликлональными анти-CAIX (Crown Bioscience, Santa Cruz) , CA, USA, разведенные 1: 100) антителами при 4°C. Был использован хромогендиаминобензидиновый субстрат (DAB). В конце образцы были окрашены гематоксилином. Во всех случаях включали положительный и отрицательный контроль обоих маркеров. Участки из образца плоскоклеточного рака, который был положительным при анализе HIF-1α и CAIX, были рассмотрены в качестве положительного контроля для обоих маркеров [13]. Были исключены первичные антитела и заменена неиммунная сыворотка на отрицательный контроль.

Оценка иммуногистохимической экспрессии HIF-1α и CAIX

Любые темные окрашенные ядра и положительное мембранное и цитоплазматическое пятно в> 1% опухолевых клеток рассматривались как положительные результаты для HIF-1α и CAIX соответственно [14].

Результаты.

В исследование были включены 90 женщин, 49 (54,4%) пациенткам было > 55 лет. Экспрессия HIF-1α, корреляция с клиническими и гистопатологическими данными, положительная экспрессия HIF-1α в карциноме молочной железы была достоверно связана со старшим возрастом пациентов, более запущенным состоянием опухоли. Экспрессия HIF-1α достоверно коррелировала с агрессивными молекулярными подтипами как HER2-амплифицированным и тройным отрицательным подтипом, с наличием метастазов в лимфатических узлах, с высоким индексом KI67 (p <0,001 для всех), с наличием отдаленных метастазов (p=0,041), с отрицательным ER (p=0,005) и PR (p=0,009), но не было существенной взаимосвязи с гистопатологическим подтипом рака молочной железы. Экспрессия CAIX, корреляция склиническими и гистопатологическим данными при карциноме молочной железы достоверно взаимосвязана со старшим возрастом пациентов, поздней стадией опухоли, агрессивным молекулярным типом, наличием метастазов в лимфатических узлах, высоким индексом KI67, агрессивными молекулярными подтипами таких как HER2-амплифицированный и тройным отрицательным подтипом (p <0,001 для всех), с более высоким (p = 0,02) отрицательным ER (p = 0,008) и PR (p = 0,027) гормональными рецепторами, но она не имела существенной взаимосвязи с гистопатологическим подтипом рака или наличием отдаленных метастазов. Экспрессия HIF-1α и CAIX в карциноме молочной железы достоверно коррелировали между собой (p <0,001).

Анализ выживаемости

После 30-месячного периода наблюдения 27,8% пациентов умерли; 3-летняя общая выживаемость составила 74,4% при среднем 32,6 ± 0,62 месяца. В конце наблюдения у 38,9% пациентов [35/90 пациентов] развился рецидив рака. Экспрессия HIF-1α и CAIX имела более высокую частоту рецидива карциномы (p <0,001).

Обсуждение результатов

Исследователи изучили роль HIF-1α, вовлеченного в развитие рака груди [15], и обнаружили, что он может влиять на скорость роста и метастатическую способность и впоследствии может быть связан с плохим прогнозом пациента [16], но полученные результаты все еще противоречивы и не содержат точных четких данных. Наши нынешние результаты показали, что когда HIF-1 положительно экспрессируется при карциноме молочной железы – это будет связано с худшими клиническими патологическими результатами, такими как более продвинутая стадия опухоли, агрессивные молекулярные подтипы, наличие пораженных лимфоузлов и отдаленные метастазы. Также обнаружили, что случаи с положительной экспрессией HIF-1α имели более частые рецидивы карциномы, плохие показатели выживаемости. Полученные результаты были близки к результатам предыдущих исследований, которые были сделаны Lee et al. [17], где оценивали экспрессию HIF-1α по отношению к маркерам ангиогенеза и другим клинико-патологическим критериям в когорте пациенток с раком молочной железы из Африки. Они обнаружили, что положительная экспрессия HIF-1α связана с увеличением ангиогенеза опухоли, высокой скоростью пролиферации раковых клеток, которая подтверждается повышенным индексом маркировки Ki-67, что указывает на HIF-1α как плохой прогностический маркер рака молочной железы и терапевтической мишени для пациентов с раком молочной железы. Была обнаружена связь между экспрессией HIF-1α и наличием пораженных лимфоузлов и отдаленных метастазов в карциноме молочной железы; наши результаты были близки к результатам Lakhani et al. [16].

HIFs играют много ролей при росте рака, пролиферации, дифференцировке, ангиогенезе, метаболизме раковых клеток, локальном вторжении, при поражении лимфоузлов и отдаленных метастазах. Кроме того, HIF-1α может увеличить экспрессию PD-L1, являющегося иммунным контрольным белком, который может быть ответственным за подавление иммунитета [18].

Исследователь Уорд и др. [4] заявили, что прогностическая ценность HIF-1α у пациентов с карциномой молочной железы имеет противоречивые результаты во многих последующих исследованиях [19]. Это было показано и в настоящем исследовании. Существует сильная связь между экспрессией HIF-1α и наличием отдаленных метастазов при карциноме молочной железы, а также HIF-1α увеличивает экстравазацию клеток карциномы молочной железы в легкие, что было объяснено Noman и др. [20] благодаря способности HIF-1 регулировать образование метастатических ниш на отдаленных участках еще до прибытия раковых клеток. Солидные злокачественные опухоли, такие как карцинома молочных желез, содержат гипоксические области из-за наличия дефектов васкуляризации в этих быстро растущих раковых клетках. HIF-1α играет существенную роль в адаптации раковых клеток к гипоксии, увеличивая транскрипцию многих генов, которые могут регулировать ангиогенез, пролиферацию, инвазию и метастазы [21].

Другим механизмом, с помощью которого может действовать HIF-1α, является перерегулирующий процесс эпителиального мезенхимального перехода (ЕМТ), который необходим для прогрессирования опухоли. ЕМТ может стимулироваться гипоксией, многими механизмами. HIF-1α индуцирует ЕМТ путем регуляции транскрипционных факторов ЕМТ, например, Twist, Snail, Slug и Zeb во многих типах рака [22].

Кроме того, гипоксия представляет собой агент, стимулирующий ангиогенез, посредством продуцирования многих транскрипционных факторов HIF-1, причем во время процесса ЕМТ HIF-1α стимулировал ангиогенез путем регуляции транскрипции VEGF и связан с ростом микроклеток, что является свидетельством активированного ангиогенеза [4]. Было обнаружено, что повышенная положительная экспрессия HIF-1α сильной связана с плохим результатом и низкой выживаемостью пациентов с карциномой молочной железы. Так же гипоксия считается отличительной чертой агрессивного поведения многих солидных опухолей и кроме того она ответственна за метастазы и резистентность к терапии. Поэтому воздействие на HIF-1α считается привлекательной терапевтической мишенью, к примеру, недавно обнаруженные ингибиторы HIF-1α [16].

Ориентация на гипоксические раковые клетки изучалась многими подходами, например, гипоксия-активированные пролекарства и специфический таргетинг HIF-1α [21]. Ингибиторы HIF-1α, такие как дигоксин и акрифлавин, имели потенциальные терапевтические роли в снижении роста рака, инвазии, метастазирования и васкуляризации при раке молочной железы [20]. Воздействие на HIF-1α рассматривается как новый терапевтический способ лечения пациентов с раком молочной железы и улучшения их прогноза, который можно использовать в сочетании с применяемыми в настоящее время терапиями. Многие исследователи изучили экспрессию CAIX при различных злокачественных опухолях человека и заявили, что она связана с плохим исходом пациента, но его роль у пациентов с карциномой молочной железы все еще нуждается в дополнительных разъяснениях [23]. В данном исследовании было доказано, что положительная экспрессия CAIX в тканях карциномы молочной железы связана с худшими клиническими патологическими данными. Было показано, что случаи с положительной экспрессией CAIX характеризовались более высокой частотой рецидивов карциномы, плохой выживаемостью [24]. Экспрессия CAIX была связана с агрессивным патологическим фенотипом, резистентностью к химиотерапии и плохим прогнозом у пациентов с раком молочной железы. Было доказано, что экспрессия CAIX при карциноме молочной железы была связана с наличием метастазов в лимфоузлах, что было похоже на результаты исследования Sobhanifar et al. [25] и Sugie et al. [26], которые обнаружили, что экспрессия CAIX сильно связана с метастазированием в дополнение к инвазии лимфатических сосудов первичными опухолями.

Было доказано, что экспрессия CAIX в карциноме молочной железы коррелирует с более крупными размерами опухолей, стадией и агрессивным молекулярным типом [27]. Supuran и Thiry et al. [28,29] обнаружили положительную корреляцию между экспрессией CAIX, агрессивным фенотипом карциномы молочной железы и неблагоприятным прогнозом для пациентов. В настоящем исследовании обнаружено, что пациенты с высокой экспрессией CAIX имели более низкие показатели выживаемости [30]. Таким образом, эти данные свидетельствуют о том, что CAIX является прогностическим маркером для пациентов с раком молочной железы. В отличие от полученных результатов [29] не было обнаружено никакой ассоциации между экспрессией CAIX в тканях рака молочной железы и поражением лимфоузлов пациентов, что может быть объяснено разными пациентами, вариабельной методикой окрашивания. Существует несколько теорий, которые могли бы объяснить связь между положительным выражением CAIX и плохим результатом пациентов при раке молочной железы. То, что экспрессия CAIX связана с гипоксией и ацидозом раковой ткани, а ее регуляция является шагом в адаптации раковых клеток к выживанию в условиях гипоксии [29]. Кроме того, CAIX связан с раковой гипоксией и стимулирует распространение и инвазию раковых клеток [29,31]. Кроме того, повышенная гипоксия в злокачественных клетках приводит к нестабильности генов. Также, CAIX может влиять на рост и выживаемость стволовых клеток рака молочной железы в условиях гипоксии [32]. Полученные результаты могут свидетельствовать о том, что обнаружение селективных ингибиторов CAIX может быть использовано для лечения больных раком и улучшения их прогноза, причем некоторые из таких ингибиторов находятся в доклинической обработке и все еще находятся на стадии оценки [33,34]. Мы обнаружили положительную корреляцию между экспрессией HIF-1α и CAIX в ткани рака молочной железы, что было похоже на результаты работы [35], отличные от [29,30]. Отсутствие связи между выражением обоих маркеров в различных исследованиях объясняется с помощью разных периодов полувыведения HIF-1α и CAIX, поскольку было обнаружено, что HIF-1α быстро разрушается и удаляется в течение нескольких минут после реоксигенации [36]. Хотя CAIX имеет более длительный период полураспада 2-3 дня [37], поэтому было заявлено, что они не могут присутствовать вместе [38].

Таким образом, оба маркера, в основном HIF-1α, участвуют в ключевом этапе метастатического процесса, например, в ЕМТ, злокачественной клеточной инвазии и образовании метастатической ниши. Будет лучше, чтобы стратегии лечения опухоли были направлены на противодействие последовательности гипоксия, гликолиз и ацидоз. Было обнаружено, что комбинация ингибиторов HIF-1α и CAIX с существующими терапевтическими методами может быть полезной клинически. Клинические испытания необходимы, чтобы определить, могут ли они увеличить выживаемость пациентов, имеющих только рак молочной железы, или в дополнение к применяемым в настоящее время методам лечения. Дальнейшие исследования необходимы для выявления более конкретных ингибиторов HIF-1α и CAIX, изучения их детального механизма действия и включения их в клинические терапевтические исследования пациентов с раком молочной железы.

Источник: https://www.omicsonline.org/open-access/prognostic-value-of-the-expression-of-endogenous-hypoxia-associated-proteins-hypoxia-inducible-factor1-alpha-hif1945-and-carbonic-99792.html

Литература

  1. Aomatsu N, Yashiro M, Kashiwagi S, Kawajiri H, Takashima T, et al. (2014) Carbonic anhydrase 9 is associated with chemosensitivity and prognosis in breast cancer patients treated with taxane and anthracycline. BMC Cancer 14: 400.
  1. Brennan DJ, Jirstrom K, Kronblad A, Millikan RC, Landberg G, et al. (2006) CA IX is an independent prognostic marker in premenopausal breast cancer patients with one to three positive lymph nodes and a putative marker of radiation resistance. Clin Cancer Res 12: 6421-6431.
  1. Bussink J, Kaanders JH, van der Kogel AJ (2003) Tumor hypoxia at the micro-regional level: clinical relevance and predictive value of exogenous and endogenous hypoxic cell markers. Radiother Oncol 67: 3-15.
  1. Ward C, Langdon SP, Mullen P, Harris AL, Harrison DJ, et al. (2013) New strategies for targeting the hypoxic tumour microenvironment in breast cancer, cancer Review Treatment 39: 171-179.
  1. Chen CL, Chu JS, Su WC, Huang SC, Lee WY (2010) Hypoxia and metabolic phenotypes during breast carcinogenesis: expression of HIF-1alpha, GLUT1, and CAIX, virchows archiv 457: 53-61.
  1. Schutze D, Milde-Langosch K, Witzel I, Rody A, Karn T, et al. (2013) Relevance of cellular and serum carbonic anhydrase IX in primary breast cancer, Journal of Cancer Research and Clinical Oncology 139: 747-754.
  1. Tan EY, Yan M, Campo L, Han C, Takano E, et al. (2009) The key hypoxia regulated gene CAIX is upregulated in basal-like breast tumours and is associated with resistance to chemotherapy, British Journal of Cancer, 100: 405-411.
  1. Elston CW, Ellis IO (2002) Pathological prognostic factors in breast cancer I. The value of histological grade in breast cancer: experience from a large study with long-term follow-up. Histopathology 19: 403-410.
  1. Lock FE, McDonald PC, Lou Y, Serrano I, Chafe SC, et al. (2013) Targeting carbonic anhydrase IX depletes breast cancer stem cells within the hypoxic niche, Oncogene 32: 5210-5219.
  1. Giuliano AE, Connolly JL, Edge SB, Mittendorf EA, Rugo HS, et al. (2017) Breast Cancer-Major changes in the American Joint Committee on Cancer eighth edition cancer staging manual. CA Cancer J Clin 67: 290-303.
  1. Glaberman UB, Marron M, Chalasani P, Livingston R, Iannone M, et al. (2016) Circulating Carbonic Anhydrase IX and Antiangiogenic Therapy in Breast Cancer Disease Markers. 7 pages
  1. Hsu SM, Raine L, Fanger H (1981) Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. J Histochem Cytochem 29: 577-580.
  1. Jiang BH, Semenza GL, Bauer C, Marti HH (1996) Hypoxia-inducible factor 1 levels vary exponentially over a physiologically relevant range of O2 tension. Am J Physiol 271: C1172-C1180.
  1. Eom KY, Jang MH, Park SY, Kang EY, Kim SW, et al. (2016) The Expression of Carbonic Anhydrase (CA) IX/XII and Lymph Node Metastasis in Early Breast Cancer Cancer Res Treat 48: 125-132.
  1. Kronblad A, Jirstrom K, Ryden L, Nordenskjold B, Landberg G (2006) Hypoxia inducible factor-1alpha is a prognostic marker in premenopausal patients with intermediate to highly differentiated breast cancer but not a predictive marker for tamoxifen response. Int J Cancer 118: 2609-2616.
  1. Lakhani SR, Ellis IO, Schnitt SJ, Tan PH, Van de Vijver MJ (2012) WHO Classification of Tumours of the Breast.
  1. Lee WY, Huang SC, Hsu KF, Tzeng CC, Shen WL (2008) Roles for hypoxia-regulated genes during cervical carcinogenesis: somatic evolution during the hypoxia-glycolysis-acidosis sequence. Gynecol Oncol 108: 377-384.
  1. Liu Z-J Semenza GL, Zhang H-F (2015) Hypoxia-inducible factor 1 and breast cancer metastasis. J Zhejiang Univ Sci B 16: 32-43.
  1. Nalwoga H, Ahmed L, Arnes JB, Wabinga H, Akslen LA (2016) Strong Expression of Hypoxia-Inducible Factor-1α (HIF-1α) Is Associated with Axl Expression and Features of Aggressive Tumors in African Breast Cancer PLOS ONE.
  1. Noman MZ, Desantis G, Janji B, Hasmim M, Karray S, et al. (2014) PD-L1 is a novel direct target of HIF-1alpha, and its blockade under hypoxia enhanced MDSC-mediated T cell activation. J Exp Med 211: 781-790.
  1. McDonald PC, Winum JY, Supuran CT, Dedhar S (2012) Recent developments in targeting carbonic anhydrase IX for cancer therapeutics, Oncotarget 3: 84-97.
  1. Rafajova M, Zatovicova M, Kettmann R, Pastorek J, Pastorekova S (2004) Induction by hypoxia combined with low glucose or low bicarbonate and high posttranslational stability upon reoxygenation contribute to carbonic anhydrase IX expression in cancer cells. Int J Oncol 24: 995-1004.
  1. Semenza GL (2010) Defining the role of hypoxia-inducible factor 1 in cancer biology and therapeutics. Oncogene 29: 625-634.
  1. Semenza GL (2012) Hypoxia-inducible factors: mediators of cancer progression and targets for cancer therapy. Trends Pharmacol Sci 33: 207-214.
  1. Sobhanifar S, Aquino-Parsons C, Stanbridge EJ, Olive P (2005) Reduced expression of hypoxia-inducible factor-1alpha in perinecrotic regions of solid tumors. Cancer Res 65: 7259-7266.
  1. Sugie T, Sawada T, Tagaya N, Kinoshita T, Yamagami K, et al. (2013) Comparison of the indocyanine green fluorescence and blue dye methods in detection of sentinel lymph nodes in early-stage breast cancer. Ann Surg Oncol 20: 2213-2218.
  1. Sun JD, Liu Q, Wang J, Ahluwalia D, Ferraro D, et al. (2012) Selective tumor hypoxia targeting by hypoxia-activated prodrug TH-302 inhibits tumor growth in preclinical models of cancer. Clin Cancer Res 18: 758-770.
  1. Supuran CT (2008) Development of small molecule carbonic anhydrase IX inhibitors. BJU Int 101: 39-40.
  1. Thiry A, Dogne JM, Masereel B, Supuran CT (2006) Targeting tumor-associated carbonic anhydrase IX in cancer therapy. Trends Pharmacol Sci 27: 566-573.
  1. Trastour C, Benizri E, Ettore F, Ramaioli A, Chamorey E, et al. (2007) HIF-1alpha and CA IX staining in invasive breast carcinomas: prognosis and treatment outcome. Int J Cancer 120: 1451-1458.
  1. Müller V, Riethdorf S, Rack B, Janni W, Fasching PA, et al. (2011) Prospective evaluation of serum tissue inhibitor of metalloproteinase 1 and carbonic anhydrase IXin correlation to circulating tumor cells in patients with metastatic breast cancer, Breast Cancer Research 13: 4-71.
  1. Wigerup C, Påhlman S, Bexell D (2016) Therapeutic targeting of hypoxia and hypoxia-inducible factors in cancer Pharmacology & Therapeutics 152-169.
  1. Wojtkowiak JW, Cornnell HC, Matsumoto S, Saito K, Takakusagi Y, et al. (2015) Pyruvate sensitizes pancreatic tumors to hypoxia-activated prodrug TH-302. Cancer Metabol 3: 2.
  1. Wong CC, Zhang H, Gilkes DM, Chen J, Wei H, et al. (2012) Inhibitors of hypoxia-inducible factor 1 block breast cancer metastatic niche formation and lung metastasis. J Mol Med 90: 803-815.
  1. Lou Y, McDonald PC, Oloumi A, Chia S, Ostlund C, et al. (2011) Targeting tumor hypoxia: suppression of breast tumor growth and metastasis by novel carbonic anhydrase IX inhibitors, Cancer Research 71: 3364-3376.
  1. Zatovicova M, Jelenska L, Hulikova A, Csaderova L, Ditte Z, et al. (2010) Carbonic anhydrase IX as an anticancer therapy target: preclinical evaluation of internalizing monoclonal antibody directed to catalytic domain. Curr Pharm Des 16: 3255-3263.
  1. Zhang W, Shi X, Peng Y, Wu M, Zhang P, et al. (2015) HIF-1alpha Promotes Epithelial-Mesenchymal Transition and Metastasis through Direct Regulation of ZEB1 in Colorectal Cancer. PLoS One.
  1. Zhang H, Wong CC, Wei H, Gilkes DM, Korangath P, et al. (2012) HIF-1-dependent expression of angiopoietin-like 4 and L1CAMmediates vascular metastasis of hypoxic breast cancer cells to the lungs. Oncogene 31: 1757-1770.

Записаться на приём! ЗВОНИТЕ +4917672237999 (Whatsapp, Viber)